Thèse Décrypter le Rôle des N-Acétylgalactosaminyltransférases 4 6 et 12 dans l'Agressivité de l'Adénocarcinome Pancréatique et la Résistance aux Chimiothérapies H/F - 13

Établissement : Aix Marseille Université
École doctorale : Recherches Biomédicales
Laboratoire de recherche : CRCM - Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille
Direction de la thèse : Eric MAS ORCID 0000000289259195
Début de la thèse : 2026-10-01
Date limite de candidature : 2026-04-26T23:59:59

L'adénocarcinome du pancréas humain (PDAC) reste le cancer digestif dont le pronostic est le plus défavorable, avec un taux de survie globale à 5 ans inférieur à 10% tous stades confondus [Bray, 2024]. Ce cancer fait l'objet d'un diagnostic tardif dû à un manque de marqueurs biologiques précoces sensibles et spécifiques, et présente une évolution rapide principalement due à la formation de métastases. Bien que les protocoles de chimiothérapie (m)Folfirinox ont permis une avancée significative dans le traitement du PDAC [Conroy, 2018], ce cancer reste malheureusement peu sensible à l'arsenal thérapeutique disponible à ce jour. Une des causes principales de cette résistance aux traitements est une variabilité génotypique et phénotypique très importante entre les patients qui fait intervenir des mécanismes moléculaires variés et complexes. Parmi ces mécanismes, nous retrouvons les processus de glycosylation qui sont à l'origine de l'apparition de structures glycosylées anormales dont l'expression est variable entre les tumeurs de patients. Ces structures peuvent être générées sur les glycoconjugués suite à une altération profonde, entre autres, de l'expression des enzymes de la glycosylation, telles que les glycosyltransférases (GT) et les glycosidases. Ces glycanes aberrants contribuent ainsi fortement à cette hétérogénéité tumorale et peuvent participer à la transformation maligne, la progression tumorale et la dissémination métastatique en perturbant les voies de signalisation, l'adhérence cellulaire, etc. [Pinho and Reiss, 2015 ; Munkley and Elliott, 2016].
Dernièrement, nous avons identifié, à partir des analyses multi-omiques effectuées sur notre cohorte de modèles pré-cliniques, une glyco-signature pronostique de plusieurs gènes de GT qui a la capacité de classifier et prédire le devenir des patients atteint d'un PDAC en terme d'agressivité et de survie [Mohamed Abd-El-Halim, 2021]. Dans ce contexte, nous avons identifié un groupe de patients de très mauvais pronostic qui est associé à une très faible expression de 3 N-acétylgalactosaminyltransférases (GALNT), la GALNT4, la GALNT6 et la GALNT12. Ces GT qui catalysent le transfert de N-acétylgalactosamine (GalNAc) sur les résidus sérine ou thréonine des protéines de type mucines lors de l'étape initiale de la biosynthèse de la O-glycosylation, pourraient produire des O-glycanes anormaux et jouer ainsi un rôle clé dans la progression des tumeurs pancréatiques. L'expression de la GALNT12, au travers de l'expression de O-glycanes anormaux, serait aussi impliquée dans la sensibilité ou la résistance au 5-fluorouracil (5-FU). Le projet visera donc à caractériser l'impact moléculaire et clinique de ces GALNT et des glycanes aberrants qu'elles génèrent, afin d'établir leur potentiel en tant que glyco-biomarqueurs histologiques pronostiques et prédictifs de la réponse aux chimiothérapies. En parallèle, le rôle de ces GT et des glycanes anormaux associés sera investigué dans les mécanismes moléculaires gouvernant la progression tumorale et/ou la sensibilité ou la résistance aux chimiothérapies. L'ensemble de ce projet sera réalisé à l'aide d'une cohorte constituée de lignées cellulaires primaires (PDC), d'organoïdes (PDO) et de xénogreffes (PDX) dérivés des tumeurs de patients et pour lesquels nous avons les données multi-omics et les tissues microarrays.
L'expression dérégulée de ces différentes GT pourrait donc contribuer à la synthèse de glycanes aberrants exprimés par les cellules tumorales pancréatiques pour favoriser l'agressivité et la résistance aux traitements du PDAC. Dans le cadre d'une médecine de précision, l'identification de glyco-biomarqueurs prognostiques et prédictifs pourrait permettre la mise en place de protocoles thérapeutiques adaptés pour une meilleure prise en charge des patients. De plus ces GT pourraient devenir de nouvelles cibles permettant le développement potentiel d'outils diagnostiques, pronostiques et thérapeutiques.

Le PDAC, l'un des cancers les plus agressifs, se caractérise par une résistance particulièrement élevée aux traitements. L'une des causes majeures de cette résistance réside dans l'importante variabilité génotypique et phénotypique observée entre les patients, incluant notamment l'apparition de structures glycosylées aberrantes. L'expression de ces glycanes anormaux résulte, en partie, d'une dérégulation profonde de l'expression des glycosyltransférases. Plusieurs études ont montré que ces glycanes, exprimés par les cellules tumorales ainsi que par les cellules du microenvironnement tumoral, jouent un rôle clé dans les mécanismes moléculaires contrôlant la progression tumorale pancréatique et la dissémination métastatique [Fig. 1A, 1B] [Pinho and Reiss, 2015].
Les modifications les plus courantes impactent la fucosylation et/ou la sialylation des antigènes (Ag) glycosylés tels que les Ag Lewis x, sialyl-Lewis x, sialyl-Lewis a et sialyl-Tn qui ont été détectés dans le cancer du pancréas [Ichihara, 1993] [Fig. 1A, 2]. Les Ag sialyl-Lewis a et sialyl-Lewis x, exprimés préférentiellement à la surface des cellules tumorales, peuvent être reconnus, dans la circulation sanguine ou lymphatique, par les récepteurs sélectines, exprimés à la membrane des cellules endothéliales et peuvent ainsi favoriser la formation de métastases [Witz, 2008]. Les mécanismes par lesquels ces structures glycosylées apparaissent impliquent nécessairement des changements dans l'expression des glyco-enzymes qui sont elles-mêmes dépendantes des multiples modifications moléculaires qui apparaissent lors de l'oncogénèse (voies de signalisation, oncogènes, voies métaboliques, régulation épigénétique, etc.). Des résultats publiés récemment ont d'ailleurs confirmés la surexpression dans le PDAC de certaines fucosyltransférases dont la FUT3 et la FUT6 et des structures sialylées dues à l'activité de sialyltransférases [Gupta, 2020 ; Wagatsuma, 2020]. Cependant, il a été observé une forte hétérogénéité dans l'expression de ces GT et glycanes aberrants entre les tumeurs [Chugh, 2018 ; Li, 2011]. Par exemple, l'expression du bio-marqueur pronostique glycosylé CA19/9 est variable selon les patients atteints d'un PDAC et ceux qui expriment des quantités importantes de CA19/9 et d'Ag glycosylé sialyl-TRA présentent un meilleur pronostic après chirurgie [Barnett, 2017]. Cet exemple illustre bien cette hétérogénéité tumorale, observée entre les patients, qui se traduit par une variabilité phénotypique très importante des tumeurs et une évolution clinique différente selon les patients.
Dans ce contexte, nous avons aussi pu mettre en évidence pour la première fois, une glyco-signature pronostique de 19 gènes de GT, tout à fait originale, qui a la capacité de classifier les patients atteints d'un PDAC en plusieurs clusters de mauvais ou de meilleur pronostic, et a aussi permis d'identifier des différences dans l'activation des voies du métabolisme des molécules de chimiothérapie associées à une modification d'expression du transcrit de la CYP3A5. Ce résultat suggère des différences de sensibilité et/ou de résistance à ces molécules entre ces clusters [Mohamed Abd-El-Halim, 2021]. Depuis la parution de ces travaux, de nombreuses études ont été publiées montrant la capacité des glyco-signatures pronostiques, fondées sur l'expression de gènes de GT, à identifier des sous-types de tumeurs pour un cancer donné [Gao, 2022 ; Rodriguez, 2022 ; Sun, 2024]. Dernièrement, notre équipe a développé plusieurs signatures ARN prédictives d'une sensibilité des tumeurs de patients à la gemcitabine, un des traitements de référence du PDAC [Nicolle, 2021, 2023 ; Fraunhoffer, 2023]. Une de ces signatures, considérée maintenant comme la plus performante, permet de prédire la réponse à la gemcitabine non seulement chez les patients ayant subi une résection de la tumeur mais aussi chez les patients atteints d'un PDAC avancé ou métastatique [Fraunhoffer, 2023 ; Nicolle, 2023].
L'ensemble de ces données suggère fortement que les profils d'expressions de certaines GT pourraient non seulement jouer un rôle clé dans les mécanismes moléculaires impliqués dans la progression tumorale mais aussi contribuer aux mécanismes de sensibilité et/ou de résistance aux chimiothérapies au travers de l'expression de certains glycoconjugués anormaux. Par exemple, il a été montré qu'une faible expression des mannosyl-glycoprotein N-acétylglucosaminyltransférases MGAT4A, MGAT4B et MGAT5, impliquées dans la formation de N-glycanes branchés multi-anténnés, était associée à une résistance au paclitaxel des cellules de cancer du sein [Cao, 2021]. Une sous-expression de MGAT5 est aussi corrélée avec une résistance à la gemcitabine dans les cellules de cancer de la vessie [Tang, 2018]. De même nous avons montré que l'expression de la GALNT4, 6 et 12 est corrélée avec une meilleure survie globale des patients souffrant d'un PDAC [Mohamed Abd-El-Halim, 2021]. Ces trois GALNT font partie de la famille des polypeptide N-acétylgalactosaminyltransférases constituée de 20 membres qui ont la capacité d'initier la O-glycosylation en transférant un N-acétylgalactosamine (GalNAc) sur une sérine ou thréonine d'une protéine de type mucine, pour former l'Ag Tn (GalNAc-1-O-Thr/Ser) puis initier l'élongation des chaines glycaniques [Bennett, 2012] [Fig. 1A ; 2]. Dans le PDAC, la GALNT6 est associée à un mauvais pronostic et son invalidation réduit la prolifération cellulaire par activation de la pyroptose (une forme inflammatoire de mort cellulaire programmée) et également la migration cellulaire en induisant un switch du P-cadhérine à l'E-cadhérine (EMT) [Ding, 2023]. À l'inverse, une étude a montré que la surexpression de GALNT6 est significativement corrélée avec une meilleure différenciation du PDAC, une tumeur de taille réduite et une diminution des invasions vasculaires [Li, 2011]. Dans le fibrosarcome, la surexpression de la GALNT12 est associée à un mauvais pronostic et son invalidation diminue la prolifération et la viabilité cellulaire par augmentation de la forme phosphorylée inactive du co-activateur transcriptionnel YAP1 (Yes-Associated Protein 1), ce qui réduit l'expression des gènes impliqués dans la prolifération cellulaire (MYC, cycline D) et la résistance à l'apoptose (BCL-1) [Yu, 2023]. Par contre, dans le cancer de la prostate, l'expression de la GALNT12 inhibe la prolifération, la migration, l'invasion et la division des cellules tumorales en activant la voie BMP (Bone Morphogenetic Protein), supprimant ainsi la formation de métastases osseuses [Yang, 2024]. Nos résultats préliminaires semblent aussi montrer une corrélation entre une diminution de l'expression de la GALNT12 et une augmentation de la migration des cellules tumorales. Il est important de noter, qu'à l'heure actuelle, aucune étude n'a montré la participation de ces GALNT dans les mécanismes moléculaires impliqués dans la progression tumorale et la sensibilité ou la résistance du PDAC aux chimiothérapies.

Les tumeurs pancréatiques présentent une importante hétérogénéité moléculaire entre les patients, qui serait, entre autres, associée à des modifications des profils d'expression des GT et des glycanes anormaux associés. La mise en place de ces modifications lors de l'oncogénèse pancréatique pourrait alors ouvrir de nouvelles opportunités pour identifier de nouveaux glyco-biomarqueurs diagnostiques, pronostiques ou prédictifs de l'efficacité d'un traitement mais aussi de nouvelles cibles thérapeutiques.
Dernièrement nous avons identifié, une glyco-signature qui, en plus de prédire la survie des patients souffrant d'un PDAC, a aussi permis de montrer, entre différents groupes de patients, des différences dans l'activation des voies de signalisation impliquée dans la sensibilité ou la résistance à certaines molécules de chimiothérapie. Ce résultat suggère que les profils d'expression des GT pourraient être associés et contribuer aux mécanismes de sensibilité et/ou de résistance aux chimiothérapies au travers de l'expression de certains glycoconjugués anormaux. Cette hypothèse a été consolidée en identifiant un certain nombre de gènes de GT dont l'expression est significativement corrélée avec une sensibilité ou une résistance de nos PDC au 5' Fluorouracile (5'FU), à l'oxaliplatine, à l'irinotecan / SN38, à la gemcitabine ou au taxol. Suite à ces résultats nous nous sommes focalisés sur trois gènes de la glyco-signature pronostique, les GALNT4, 6 et 12, qui pourraient jouer un rôle clé dans les mécanismes moléculaires impliqués aussi bien dans la progression tumorale que dans la sensibilité et/ou résistance aux chimiothérapies. En particulier la GALNT12 serait associée à une sensibilité au 5'FU. De plus, des résultats préliminaires semblent montrer une corrélation entre une diminution de l'expression de la GALNT12 et une augmentation de la migration des cellules tumorales.
Objectifs : Le projet visera donc à caractériser l'impact moléculaire et clinique de ces 3 GALNT et des glycanes aberrants qu'elles génèrent, afin d'établir leur potentiel en tant que glyco-biomarqueurs histologiques pronostiques et prédictifs d'une sensibilité aux molécules de chimiothérapie. En parallèle, le rôle de ces GT et des glycanes anormaux associés sera investigué dans les mécanismes moléculaires gouvernant la progression tumorale et/ou la sensibilité ou la résistance aux chimiothérapies.

1. Identification de glyco-biomarqueurs histologiques prédictifs d'une sensibilité aux chimiothérapies.
Suite aux résultats suggérant l'implication des GALNT dans les mécanismes moléculaires impliqués dans la progression tumorale et la sensibilité aux chimiothérapies, il est très important de vérifier si les profils d'expressions de ces GT et leurs glycanes aberrants peuvent servir de glyco-biomarqueurs prédictifs.
En effet l'expression des ARNm codant pour les GALNT, est significativement corrélée avec une sensibilité au 5'FU. Ce résultat suggère une modification de l'expression des Ag Tn, sialyl-Tn, T et sialyl-T, etc. [Fig. 1A ; 2] dans les cellules tumorales résistantes au 5'FU ce qu'il faudra vérifier.
Nous déterminerons donc le profil d'expression de ces trois GALNT à l'aide d'anticorps (Ac) spécifiques, (1) par western-blot, microscopie confocale et cytométrie en flux sur les PDC et les PDO de notre cohorte ; (2) par immunohistochimie (IHC) sur nos TMA. Cette étude sera complétée par la quantification de leurs ARNm par RT-qPCR et corrélée avec nos analyses RNAseq. Nous utiliserons aussi des lectines et des Ac dirigés contre les Ag glycosylées, tels que les Ag T, Tn, sialyl-T, sialyl-Tn, Lewis a, Lewis b, Lewis y, sialyl-Lewis x ainsi que 2 Ac qui sont utilisés en routine clinique par les anatomo-pathologistes, dirigés contre le Lewis x (Carb3) et le sialyl-Lewis a (CA19-9) qui est le seul glyco-biomarqueur utilisé actuellement pour le pronostic du PDAC [Fig. 1A ; 2].
Ces Ac nous permettront d'évaluer la qualité et la quantité de glycanes exprimés dans les PDC, les PDO et les PDX en corrélation étroite avec les données de chimio-grammes et les analyses RNAseq. Si les résultats attendus se confirment, il sera alors possible de définir des combinaisons d'Ac dirigés contre ces glyco-biomarqueurs histologiques (antigène.s. glycosylé.s. et/ou glycosyltransférase.s.) qui pourraient permettre de déterminer la sensibilité de la tumeur aux chimiothérapies.

2. Rôle des GALNT4, 6 et 12, et des glycanes aberrants dans les mécanismes moléculaires impliqués dans la progression tumorale et la sensibilité ou la résistance aux chimiothérapies.
En plus de la possibilité que ces GT et glycanes aberrants pourraient être des glyco-biomarqueurs prédictifs, il est aussi probable que ces glyco-enzymes puissent avoir une participation active, au travers de la biosynthèse de glycoconjugués aberrants, directement ou indirectement sur les mécanismes moléculaires impliqués dans la progression tumorale et la sensibilité ou la résistance des tumeurs aux chimiothérapies.

* Le rôle des GALNT, sera donc recherché par des techniques d'invalidation et de surexpression de gènes dans les PDC et PDO en utilisant des vecteurs plasmidiques ou lentivirus commerciaux intégrant des shRNA spécifiques ou des cDNA codant pour ces 3 GALNT. Les PDC/PDO auront été préalablement sélectionnées en fonction du niveau d'expression des 3 GT corrélée avec leur sensibilité ou leur résistance aux molécules thérapeutiques. Ces modifications d'expression seront réalisées individuellement et en combinaison afin de se rapprocher des profils d'expression observés chez les patients. L'impact de ces modifications sur l'expression des GT et des glycoconjugués sera analysé selon les techniques décrites dans la partie 1 du projet.

* Des tests de cytotoxicité cellulaires seront ensuite réalisés sur les différents modèles cellulaires obtenus (sur- ou sous-exprimant une, deux ou trois de ces GALNT) pour déterminer leurs niveaux de résistance aux molécules thérapeutiques dont le 5'FU. Pour ce faire, les cellules seront cultivées en 3D (milieu de culture ou inclus dans différents types de matrices : matrigel, collagène, etc., pour mimer l'impact des traitements dans des conditions complexes d'intéractions cellules-cellules-matrice extracellulaire) et en 2D, en présence ou non de différentes concentrations d'agents thérapeutiques. Les IC50 et/ou les aires sous la courbe seront déterminées après analyse de la cytotoxicité par dosage colorimétrique et à l'aide d'un système Incucyte qui permet d'analyser les cellules vivantes en fonction du temps. Les volumes des tumoroïdes seront quantifiés par analyse d'image (vidéo-microscopie EVOS et système Incucyte) après avoir préalablement marqué les cellules avec un fluorochrome.

* Ces trois GALNT et leurs glycanes pouvant aussi jouer un rôle sur la progression et l'agressivité tumorale, des expériences de prolifération, de migration (blessure / cicatrisation) et d'invasion cellulaire en chambre de Boyden ou sous forme de tumoroïdes inclus dans différentes matrices (cf. ci-dessus) seront réalisées sur les différents modèles cellulaires obtenus.

* Afin d'explorer plus en profondeur l'impact de ces trois GALNT dans les mécanismes moléculaires impliqués dans la progression tumorale et dans la chimio-sensibilité ou la chimio-résistance des différents modèles cellulaires, les glycoconjugués impactés par l'expression de ces GALNT seront caractérisés après immunoprécipitation à l'aide d'Ac et/ou lectines spécifiques des glycanes modifiés et analyses par la plateforme de protéomique du CRCM. Ces résultats seront complétés et corrélées avec des analyses transcriptomiques et des analyses différentielles d'enrichissement des voies fonctionnelles.

* Les résultats obtenus sur la progression tumorale et la chimio-sensibilité ou la chimio-résistance seront ensuite validés in vivo. Les différents modèles cellulaires testés seront préalablement infectés par un vecteur contenant l'ADNc codant pour la luciférase pour suivre la croissance tumorale par imagerie en bioluminescence.

* Nos résultats ont montré que les tumeurs des différents groupes de patients identifiés par notre glyco-signature pronostique se distinguent par des différences importantes dans la qualité de l'infiltrat immunitaire et du stroma desmoplasique [Mohamed Abd-El-Halim, 2021]. L'expression de glycanes anormaux peut, en effet, impacter le profil des cellules immunitaires au sein d'une tumeur favorisant ainsi une immunosuppression [Rodriguez, 2018]. Afin de déterminer si ces trois GALNT, au travers des glycanes qu'elles vont produire, peuvent impacter le paysage immunitaire et la qualité du stroma de la tumeur pancréatique, une étude pilote sera menée, fondée sur le développement de modèles syngéniques de tumeurs orthotopiques à partir de cellules pancréatiques modifiées pour sous- ou surexprimer ces GALNT individuellement ou en combinaison. Les tumeurs obtenues seront alors analysées par la technologie MACSima afin de mesurer plusieurs dizaines de marqueurs de manière simultané, pour cartographier précisément l'expression de ces GALNT et leurs glycanes, l'infiltrat immunitaire et les cellules du microenvironnement. Des analyses transcriptomiques en single cell RNA-seq viendront compléter cette étude.